荧光原位杂交(FISH)探针的制备及其应用 – 实验方法

一、概述

1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征。。

2、常见染色体异常类型

3、染色体异常的检测

二、荧光原位杂交及其探针

1、荧光原位杂交的原理

2、荧光原位杂交的探针

三、荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交(按试验流程介绍)

一、 概述

1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征。。

1914年德国遗传学家Boveri就提出染色体畸变与肿瘤起源相关,但这只是一个假设。;1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML在后来被称为费城染色体的患者中发现(PH)。 染色体微小染色体;1973年Rowley证实了Ph染色体是9号和22号染色体易位所致,这是在癌症中识别的第一个染色体易位。;目前,已经有11个,报告500篇55篇,超过600个克隆性细胞遗传学异常。这些染色体畸变,尤其是染色体易位及其相应的融合基因。,很清楚克隆细胞遗传学异常是其特征。,它在肿瘤的起源中起着重要的作用。。

以下是克隆染色体异常的报告数

2、常见染色体异常类型

两种异常染色体指数与异常结构:前者包括整个染色体数目的扩增和删除。;后者包括染色体易位。、插入、倒置、区域的删除或放大。。

以下是染色体数目异常。

染色体结构异常

3、染色体异常的检测

染色体异常的识别得益于二十世纪六十年代后发展起来的胰蛋白酶-姬姆萨染色和常规显带技术,常规筛选全基因组染色体异常是可能的。。染色体显带是细胞遗传学研究中常用的一种方法。,但这需要时间,并取决于获得一个良好的分裂阶段。,复杂的和隐藏的异常是很难分析的。。

PCR或荧光原位杂交(FISH,fluorescent in situ hybridization)对染色体异常的检出依赖于引物或探针与模板的结合,因此,它比常规条带更为具体。,它是一种灵敏、特异的高通量检测色度的方法。。

二、 荧光原位杂交及其探针

1、荧光原位杂交的原理

染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合,这种结合开辟了一门新学科——分子细胞遗传学。。它的基础是南部。 印迹原理,半抗原,如生物素、地高辛间接标记或直接用荧光素标记。,探针和靶序列后的双链DNA变性与杂交,互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,用荧光标记的抗生物素蛋白或地高辛抗体显示半抗原。,杂交信号通过荧光显微镜观察。。鱼又快又灵敏。、特异性好的特点,多个细胞可以同时在分相和相间进行分析。,并进行定量分析。;可检测隐匿或微小染色体畸变和复杂核型。;也可使用多种荧光标签。,显示DNA片段和基因的相对位置和方向,空间精密定位。

2、荧光原位杂交探针的类型

鱼的技术种类很多。,发展迅速,事实上,有必要获得能够补充目标SE的探针。。常用探针有三种。:1、染色体重复探针,主要是着丝粒α卫星。 DNA重复序列探针和端粒重复探针,用于检测染色体异常。,同时,当显示G时,,端粒区苍白。,因此,涉及这一区域的易位通常是难以检测的。,端粒探针弥补了G显带的不足。;2、染色体涂染探针,包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针,用于检测染色体数目或结构异常。;3、单染色体探针,包括各种人工染色体探针。,例如,酵母人工染色体(酵母) artificial chromosome, 雅克)、细菌人工染色体(细菌) artificial chromosome, BAC)、P1人工染色体(P1) artificial chromosome, 探针),主要用于染色体易位的鉴定。、缺失扩增。

α卫星DNA(α) satellite DNA)是唯一一个存在于所有人类染色体着丝粒区域的着丝粒DNA(centromere DNA,CEN-DNA)家族,由171bp单体组成的高度重复序列。,重复上百次数千次。,横跨100kb的着丝粒DNA区域,杂交将产生强烈的杂交信号。。因此,它常被选为着丝粒探针的来源。。

he Wellcome Trust Sanger 学会(欣克斯顿), Cambridge)由Wellcome Trust和British Medical Research 理事会联合设立,这是世界上早期大规模的人类基因组测序,并具有C。该中心使用高容量的载体(如粘土颗粒)。、BAC、PAC等。构建了人类基因组大片段DNA文库。,通过文库中末端相互重叠的DNA片段连接成叠连群(contig)并与鸟枪法相结合,基因组测序加速。,实现人类基因组计划(人) Genome Project,人类基因组(物理图谱)物理图谱 映射)和基因组测序。。因此,这些克隆为基因图谱研究提供了丰富的DNA。 序列资源,NCBI Clone Registry()、Ensembl Genome Browser

和UCSC Genome Bioinformatics()提供的网络生物信息学资源也记载了许多克隆基因组定位的详细信息,选择相应的克隆作为歌唱的来源是很方便的。。

人类基因组大片段DNA文库的构建

普通生物活性炭、PAC文库

鸟枪测序和人类基因组的物理图谱

位置搜索、PAC克隆常用数据库

三、 荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交

实验流程

第一天

缺口平移标记探针

试剂准备

(1) 0.1mmol/L dNTP

0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L 等体积混合。

(2) 0.1mmol/L dTTP

体积为0.3MML/L的1倍 DTTP和2倍量的三汽水混合。。

缺口平移系统与反应条件

0.1mmol/L dTTP 6.5μl

0.1mmol/L dNTP 10μl

10× Nick Translation buffer 5μl

1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP μl

Nick Translation Enzyme 10μl

DNA (1μg) X μl

H2O 18-X μl

in total 50μl

上面标明1亩 DNA缺口翻译系统,如果你标记更多的DNA,试剂和反应体系的用量应加倍。。所有成分混合,然后离心很短时间。。对于小于10kb的质粒,在摄氏15度 反应时;对于BAC/PAC,在摄氏15度 反应9小时。

凝胶电泳决定探针的大小。

将EP管放在冰上。,占其中的5 在70℃加热5分钟后,2 用琼脂糖凝胶电泳观察标记的大小。,单探针的尺寸为200~600 bp。;例如,片段的大小太大。,则在摄氏15度延长反应10~30分钟,重复凝胶电泳。,直到获得合适尺寸的探针。。

终止反应

在反应体系中加入1微米L。 M EDTA和(或)加热70分钟,加热5分钟。,失活酶。探针储存在-C 20℃。。

第二天

1. 探针的沉淀与变性

探针混合物组成

(1) BAC/PAC探针

DNA探针 5ul

Human Cot-1 DNA 3ul

Salmon Sperm DNA ul

H2O ul

in total 10ul

(2) 丝探针:

DNA探针 5ul

Salmon Sperm DNA ul

H2O 4.5ul

in total 10ul

DNA沉淀

将探针混合物与1L(V/10)3M混合。 乙酸钠(())和(绝对)乙醇(- 20冷冻)混合,在80℃下沉淀30min(或20℃过夜),在4℃离心14min,离心30min,为了沉淀DNA。

清洁沉淀

小心放弃上清液。,使用70 一次用乙醇洗涤。,15min离心4℃,再离心140g。;小心放弃上清液。,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。

注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变成半透明的。;我们必须彻底清除乙醇。,否则,它将加入主控器。 混合产生微小的沉淀物。,导致高背景。

溶解探针

添加5μL 去离子甲酰胺预热至37度(pH) 7.0),短时间离心后,在37度下摇30min完全溶解。;将主机预热至37摄氏度。 Mix 5μl,短时间离心后,在37℃下摇动15~30分钟。。

注:尽可能长时间晃动。;DNA沉淀也可溶解在TE缓冲液L中,并添加VISA探针。,搅拌后瞬时离心,37~15分钟振荡。

探针的变性与预杂交

短时间离心后,探针10min经80度修饰。,冰浴5分钟;短时离心,在37度水浴中预混合30~60min。;独特的序列探针(如cDNA)和重复探针(如α-S),不需要预杂交。。

2. 标本(染色体靶DNA)的处理与变性

跌落与老化

移除储存在-20℃的细胞悬浮液样品。,1100 每分钟转数。10min沉淀细胞离心试验,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,杂交区域,晾干;预热到 37℃ 的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);轮流70 %、90 和100 梯度乙醇的连续脱水,每缸2分钟,空气干燥(以下简称D型乙醇脱水)。

2.2 RNase 消化

在每个幻灯片上加30微米L。 100μg/ml RNA酶(10mg/ml核糖核酸酶) 稀释100倍的贮存溶液,盖22×22mm盖玻片。,在37度湿箱中孵育1小时。;室温下的振荡洗涤2×SSC,5分钟/次3次。;梯度乙醇脱水干燥。

靶DNA变性

将玻璃预热至72℃(添加一个滑块),在1摄氏度时,温度应提高70。 去离子甲酰胺/ 2×SSC变性2分钟后。,立即放置预冷却至-20℃的梯度乙醇脱水。

蛋白酶消化

将50μl 100 胃蛋白酶(Mg/ml) 加入50ml蒸馏水预热至37℃(pH) 2.0,用中度稀盐酸酸化,混匀;将修改后的玻片放入其中10分钟。;室温下振荡洗涤1×PBS,5分钟/次2次。;室温下梯度乙醇脱水干燥。

注:靶DNA变性和消化应与探针变性同步进行,尽快完成杂交。。

3. 杂交

将修饰的DNA探针添加到玻璃杂交区。,盖22mm×22mm盖玻片。,密封件放在湿盒子里。,晚上37点C。

第三天

1. 杂交后的洗涤和半抗原信号扩增

杂交后

小心拆卸胶粘剂并盖好玻璃。,玻璃放在50预热到46摄氏度。 甲酰胺/ 2×SSC,5min×3缸;在室温下将玻璃滑动到4×SSC/0.1。 % TWEN-20振荡洗涤5min×2缸;每个幻灯片加30。 MUL堵塞液1,盖22mm×22mm盖玻片。,37℃湿箱培养30min;再次在室温下将玻璃滑动到4×SSC/0.1。 % TWEN-20振荡洗涤5min×2缸。

注:在此步骤后,应注意避免光操作。。

放弃一个

将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和 μl Texas-red-Avidin 100稀释 μl 抗体稀释1,混匀;每个幻灯片加25。 μl 混合区,盖22mm×22mm盖玻片。,在湿箱中用37度孵育1小时。;室温4×SSC/0.1 % TWEN-20振荡洗涤5min×2缸。

降二防

将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat 抗亲和素 100稀释 μl 抗体稀释1,混匀;每个幻灯片加25。 μl 混合区,盖22mm×22mm盖玻片。,37℃湿箱培养40min;室温4×SSC/0.1 % TWEN-20振荡洗涤5min×2缸。

滴加三抗

将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和 μl Texas-red-Avidin 100稀释 μl 抗体稀释1,混匀;每个幻灯片加25。 μl 混合区,盖22mm×22mm盖玻片。,37℃湿箱培养30min;室温4×SSC/0.1 % TWEN-20振荡洗涤5min×2缸。

注:上述步骤由两种颜色的鱼来描述。,如果选择单色鱼,可以选择相应的抗体。。

2. 核染色与抗荧光猝灭剂

将5 μl 5 mg/ml的DAPI加入到50 ml 2×SSC(最终浓度125) ng/ml,远离光线,储存在4℃。,混匀;把幻灯片放进去。,避光重染2min;2×SSC清洗5min;梯度乙醇脱水空气干燥;每张玻片滴加10 μl 抗荧光猝灭剂,盖22mm×22mm盖玻片。,20℃保存。

3. 荧光杂交法检测鱼类杂交信号

荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas 中/间期荧光杂交信号的观察,细胞计数与图像采集。分别分析100~200个间期核细胞。,重叠、破损、不能去除细胞质和微弱杂交信号的细胞核I。双色双融合鱼,细胞内杂交信号彼此接近。<1/10核直径的距离)者计为一个信号。

4. 储存数据

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